Токсикологическая оценка комплексного антибактериального препарата Ципровентор

Енгашев Сергей Владимирович, доктор ветеринарных наук, профессор, генеральный директор ООО «НВЦ Агроветзащита», Москва

Павленко Галина Ивановна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории токсикологии всероссийского научно – исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Филимонов Денис Николаевич, аспирант Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, младший научный сотрудник ООО «НВЦ Агроветзащита», Москва

В условиях субхронического воздействия препарат «Ципровентор» вызывал достоверные изменения со стороны нервной системы, массы животных, крови (снижение гемоглобина) и тенденцию к снижению поведенческих показателей. Это показывает, что препарат обладает незначительной как материальной, так и функциональной кумуляцией. Однако все изменения проявлялись только на уровне доз, в несколько раз больших, чем практические, и в условиях многократного введения. В связи со сказанным препарат не представляет реальной опасности в условиях лечении сельскохозяйственных животных и птицы.

Ключевые слова: крысы, мыши, ципровентор, острая токсичность, подострая, кумуляция, кровь, печень.

Введение. В настоящее время возрастает значение фармакопрофилактики и лечения болезней сельскохозяйственных животных в связи с появлением инфекций со сложной этиологией, обусловленной повышением вирулентности условно-патогенных микроорганизмов. Часто эти болезни имеют общую симптоматику поражения дыхательных путей или пищеварительного тракта, приобретают характер смешанных инфекций, отличающихся от классических форм проявления той или иной болезни, осложненным течением. [1, 6].

В специализированных хозяйствах, особенно в межхозяйственных предприятиях, широкое распространение получили желудочно-кишечные болезни молодняка сельскохозяйственных животных, на долю которых приходится до 80% общей заболеваемости [3]. Комплексное изучение их этиологии показало, что на фоне нарушениях технологии получения, и выращивания молодняка, возбудителями диарей у телят являются энтеропатогенные и энтеротоксигенные эшерихйи, псевдамонады, энтеробактеры, протеи, стрептококки, сальмонеллы и др. [2, 15, 18].

Огромный экономический ущерб, причиняемый животноводческим хозяйствам желудочно-кишечными заболеваниями, вызывает необходимость поиска путей и методов совершенствования и изыскания новых эффективных средства, их профилактике и лечении.

Применение антибактериальных препаратов в животноводстве и птицеводстве является неотъемлемой частью технологии выращивания и обеспечения получения здорового поголовья. Эффективность лечения инфекционных заболеваний антимикробными препаратами зависит от правильного выбора лекарственного средства с учетом чувствительности к нему возбудителя, выбора оптимальной дозы, кратности и длительности его применения, что возможно после постановки точного диагноза, выделения возбудителя заболевания и определения его чувствительности.

Фирмой ООО «НВЦ Агроветзащита» разработан новый комплексный препарат на основе антибиотиков относящихся к группе фторхинолонов и аминогликозидов – Ципровентор.

В задачу наших исследований входило изучение острой токсичности, кумулятивных свойств комплексного препарата и функциональное состояние печени.

Материалы и методы. По внешнему виду препарат представляет собой желтый порошок. Экспериментальные исследования по изучению острой токсичности были проведены на белых крысах (24 головы) и белых мышах (24 головы). Животных содержали в виварии, согласно санитарным правилам и на стандартном рационе в соответствии с Приказом МЗ СССР №1045-73 от 06.04.1973 г.[11]; Правилами лабораторной практики [7] и Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 г.[12].

Животные получали сухой брикетированный корм ПК-120 ГОСТ Р51849-2011 Р.5 (ООО «Лабораторкорм», г. Москва). Вода для питья – водопроводная. Животных содержали в виварии при температуре воздуха 20-22 градуса и относительной влажности – 60-70%.

Подготовку животных к опыту осуществляли методом «случайных чисел», используя в качестве критерия массу тела. Исходный вес животных колебался в пределах 190-200 г для крыс и 20-21г для мышей. В опыт брали клинически здоровых животных, которые предварительно выдерживались на 15- дневном карантине. Для введения в желудок была приготовлена 50% суспензия. Были испытаны 4 дозы: 3, 6, 8 и 10 г/кг массы тела. При этом объём вводимой суспензии для крыс составлял 1,2- 4,0 мл, для мышей - 0,12-04 мл. При исследовании руководствовались утвержденными Методическими рекомендациями [5, 13].

Состояние периферической крови оценивали на гематологическом анализаторе Сell-dyn. Определяли количество гемоглобина, лейкоцитов и эритроцитов. Кроме того, использовали различные расчетные величины, отражающие физико-химические свойства эритроцитов, позволяющие количественно характеризовать важные показатели состояния эритроцитов [8].

При изучении влияния препарата на печень использовались показатели, характеризующие обезвреживающую и белковообразовательную функции органа.

О белковообразовательной функции печени животных судили по содержанию общего белка в сыворотке крови (на рефрактометре).

Обезвреживающая функция печени исследовалась по способности органа синтезировать гиппуровую кислоту (метод Квика-Пытеля в модификации Н.Г.Степановой, 1962) [14].

Результаты исследований и их обсуждение.

Изучение острой токсичности препарата «Ципровентор».Препарат в виде суспензии насильно вводился в желудок с помощью металлического зонда. Были испытаны 4 дозы: 3, 6, 8 и 10 г/кг массы тела. Каждая доза вводилась 6 животным. Контрольные животные получали воду в тех же объемах. За животными вели наблюдение в течение 2-х недель после введения, отмечая сроки гибели или выздоровления животных. Учитывали общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхания, реакцию на внешние раздражители.

Результаты представлены на таблице № 1

Таблица №1 - Результаты острой токсичности препарата «Ципровентор» в опыте на крысах и мышах.

Как следует из таблицы, в результате введения препарата в диапазоне доз 3-10 г/кг, гибели животных не выявлено, поэтому DL₅₀ определить не представляется возможным. Максимально-переносимой дозой препарата в однократном опыте следует считать дозу – 10 г/кг.

Клиническая картина интоксикации животных не выражена. Все опытные животные были активны, подвижны, хорошо принимали корм и практически не отличались от контрольных животных. При проведении патологоанатомического вскрытия была отмечена незначительная гиперемия слизистой желудка у крыс после введения дозы 10 г/кг. Макроанатомических изменений печени, почек, сердца и селезёнки выявлено не было.

Таким образом, препарат «Ципровентор», согласно классификации (ГОСТ 12.1.007-76) [10], относится к 4-му классу токсичности (малотоксичное соединение).

Изучение кумулятивных свойств препарата «Ципровентор»в подостром эксперименте. Использовался метод, рекомендованный для нетоксичных соединений. Препарат вводился в желудок белых крыс в постоянной дозе, составляющей 1/5 от максимально-введённой дозы (10 г/кг). Ежедневно вводимая доза составляла 2,0 г/кг (0,8 мл 50% суспензии на 200 г м.т.), с постоянной корректировкой дозы в зависимости от массы тела животных. Длительность эксперимента 19 дней. Результаты представлены в таблице №2.

Таблица №2 - Результаты определения гибели животных в подостром эксперименте.

Результаты определения параметров токсичности представлены в таблице №3.

Таблица №3 - Результаты определения параметров токсичности препарата «Ципровентор» в условиях повторного эксперимента.

Обозначения: Z-среднее арифмeтическое из числа животных, у которых отмечен учитываемый эффект под влиянием 2-х смежных доз; d – интервал   между 2-мя смежными дозами.

Графический анализ зависимости «доза-эффект» позволяет определить  смертельные дозы - лд₁₆ и лд₈₄, которые составили - 25,1 г/кг и 36,5 г/кг, соответственно. Стандартную ошибку устанавливали по формуле Гаддама: где К = 0,564;  d-средняя интервалов между  дозами=3,0; «s» рассчитывается по следующей формуле:

В итоге «стандартная ошибка» составила: 0,96

Таким образом, ЛД_50п препарата в условиях повторного введения составила 30,6±0,96 г/кг массы тела.

Коэффициент кумуляции (K_cum) рассчитывался по отношению  эффективных доз  подострого и острого опытов:

МПД – максимально – переносимая доза.

В результате K_cum составил 3,1, что, согласно классификации Ю.С.Кагана [4], относит препарат «Ципровентор» к 3 классу опасности ( умеренная кумуляция).

Для выявления функциональной кумуляции животные обследовались на 5, 10 и 15 дни опыта (при этом животные получили суммарные дозы -10, 20 и 30 г/кг, соответственно). Следует сказать, что эти дозы в несколько раз больше доз, рекомендуемых производителем в инструкции по применению. Результаты представлены в таблицах № 1 - 5.

У опытных животных, уже начиная с 10 дня эксперимента, намечается тенденция к уменьшению массы тела животных, а на 15 день, после получения суммарной дозы 30 г/кг, отмечалось достоверное его снижение. На том же сроке достоверно повышался суммационно – пороговый показатель (СПП), что свидетельствует о заторможенности животных.

Результаты измерения ректальной температуры, анализа гематологических показателей и некоторых поведенческих реакций животных представлены на таблице № 4.

Таблица №4 - Состояние некоторых показателей крыс в подостром эксперименте.

Как следует из представленных данных, из показателей, характеризующих функциональное состояние периферической крови, было отмечено снижение количества гемоглобина (при Р<0,05) на 15 день. Все остальные показатели крови у  опытных животных достоверно не отличались от контроля и не выходили за границу физиологической нормы для данных показателей. На том же сроке было отмечено достоверное снижение ректальной температуры.

Функциональное состояние печени оценивалось по способности органа синтезировать гиппуровую кислоту (обезвреживающая функция) и по содержанию в сыворотке крови общего белка (белковообразовательная функция).

Не менее важными для жизнедеятельности организма животных в целом, а также для оценки печени, является определение в сыворотке крови общих SH-групп.

Сульфгидрильные группы (SH-группы) – это функциональные группы в молекулах органических соединений, в т.ч. белков, определяющих их функциональные специфические свойства. SH-группы играют важную роль в образовании внутримолекулярных связей; в том числе –S-s-связи, которая в свою очередь обеспечивает жесткое скрепление отдельных полипептидных цепей, например, в иммуноглобулинах.

Результаты определения названных показателей представлены  на таблице №5.

Таблица №5.Некоторые показатели функционального состояния печени животных в конце эксперимента (на 15 день).

Как следует из таблицы, у опытных животных на данном сроке, в данных условиях выявлено достоверное уменьшение содержания в моче гиппуровой кислоты, что свидетельствует о снижение обезвреживающей функции печени. Все остальные показатели, характеризующие функцию печени, у животных, подвергавшихся повторному воздействию препарата в суммарной дозе, составляющей 30,0 г/кг, достоверно не отличались от контрольных величин.

После окончания опыта, животных убивали и определяли массовые коэффициенты внутренних органов. Результаты представлены в таблице № 6.

Таблица № 6 - Массовые коэффициенты внутренних органов животных, подвергавшихся воздействию препарата «Ципровентор».

Как следует из таблицы, массовые коэффициенты органов у животных опытной группы находились на одном уровне с контролем и достоверно от него не отличались, что свидетельствует о том, что этот показатель не является определяющим при воздействии  данного препарата.

Заключение. В результате проведенных токсикологических исследований, установлено, что препарат относится относится к 4-му классу токсичности (ГОСТ 12.1.007-76). Однако все изменения (со стороны нервной системы, массы животных, снижение гемоглобина, снижения поведенческих показателей) проявлялись только на уровне доз, в несколько раз больших, чем практические, и в условиях многократного введения. Это показывает, что препарат обладает незначительной как материальной, так и функциональной кумуляцией (K_cum составил 3,1, что, согласно относит препарат «Ципровентор» к 3 классу опасности). В связи со сказанным препарат может широко применяться при лечении инфекционных заболеваниях сельскохозяйственных животных и птицы.

Toxicological assessment of a complex antibacterial preparation Tsiproventor

Engashev S.V., Filimonov D.N., Pavlenko G.I.

In the conditions of subchronic influence the preparation "Tsiproventor" caused reliable changes from nervous system, mass of animals, blood (decrease in hemoglobin) and a tendency to decrease in behavioural indicators. It shows that the preparation possesses an insignificant both material, and functional kumulyation. However all changes were shown only at the level of doses, several times big, than practical, and in the conditions of repeated introduction. In connection with told a preparation doesn't constitute real danger in conditions treatment of farm animals and birds.

Keywords: rats, mice, acute toxicity, the subsharp, cumulation, blood, liver.

Список литературы:

1. Бурлаков В.А. Проблема борьбы и профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка животных / В.А. Бурлаков, В.Б. Родионова, М.М. Интизаров // Ветеринарная медицина. – 2002. – № 1. – С. 6-7.

2. Вавина О.В. Иммунокоррегирующее влияние ксимедона при острых кишечных заболеваниях у телят / Вавина О.В., Молев А.И. Великанов В.И. и др. // Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных: Материалы международной конф.посвящ. 100-летию В.Т. Котова. - Воронеж, 1999. -С.16-17.

3. Иноземцев В.П. Профилактика незаразных болезней — основа сохранности животных / Иноземцев В.П., Самсонов О.В., Таллер Б.Г // Ветеринария. — 2000. - №11 -С. 9-13.

4. Каган Ю.С. Профилактическая токсикология / Каган Ю.С. – М.: Здоровье Т.2, часть 1, 1984, с. 219.

5. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности: Руководство от 1 июня 2010 № Р 4.2.2643-10 / М.: 1998, ч.1, с.3

6. Мищенко В.А. Меры борьбы с диареями новорожденных телят / В.А. Мищенко, Н.А. Яременко, Д.К. Павлов // Ветеринария. – 2002. – № 4. – С. 16-19.

7. Правила лабораторной практики : Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23.08.10 №708н // Собрание законодательства Российской Федерации. – 2011. – № 14. – Ст. 2048.

8. Предтеченский В.Е. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Предтеченский  В.Е. – М.: Медгиз, 1960, с.315.

9. Прозоровский В.Б. Рекомендации по статистической обработке результатов токсикологических исследований / Прозоровский В.Б. – М.: 1965, 36с.

10. ССБТ Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности: Постановление Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 10 марта 1976 г. – Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/5200233.

11. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально биологических клиник (вивариев) : Приказ Министерства здравоохранения СССР от 6.04.73 № 1045-73 // Собрание законодательства Российской Федерации. – 1998. – № 17. – Ст. 2357.

12. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (Токсикометрия) /. Саноцкий И.В. – М. : Медецина, 1970. – 321 с.

13. Сперанский С.В. О преимуществах использования  нарастающего тока при изучении способности белых мышей к суммации подпороговых импульсов / Сперанский С.В – М. : Фарм. и токс., 1965, с.123-124.

14. Степанова Н.Г. Модифицированный метод исследования функции печени у мелких лабораторных животных / Степанова Н.Г. – М.: Лаб. дело, 1962, 5, с. 49-52.

15. Субботин В. В. Основные элементы профилактики желудочно-кишечной патологии новорожденных животных / Субботин В. В., Сидоров М. А. // Ветеринария. -2004. - № 1 - С. 3 – 6.

16. Травина О.В. Руководство по биохимическим исследованиям / Травина  О.В. – М.: Государственное издательство медицинской литературы, 1955, с.178.

17. Фоломеев Ф.И. Фотоколориметрический микрометод определения  SH- групп белка и небелковых соединений  крови / Фоломеев Ф.И. – М.: Лабораторное дело, 1981, 1, с. 33-35.

18. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях / cб.науч.тр. - Воронеж, 2002. - с.3-8.